AAV腺相关病毒注射方式——心脏篇

AAV（Adeno-Associated Virus）是一种常用的基因传递工具，被广泛应用于心血管疾病的治疗研究中。心血管注射是一种将AAV载体注射到心血管系统的方法，以实现基因治疗的目的。心血管主要研究心肌或血管的相关模型，下面先跟大家学习下AAV在心脏研究的注射方式。

AAV在心脏的注射方式有多种，具体选择取决于目标区域是整个心脏还是特定部位（如心肌梗死区）。若需转导整个心脏，可选择静脉注射（颈静脉，尾静脉，眼眶静脉等）、动脉注射或心肌原位多点注射。而针对心脏的特定区域，则可以通过外部注射或直接在心内膜表面注射，以实现精准递送。如下图：

各方式优缺点比较

然而目前研究最多的是整个心脏的，通常文献报道较多的是心肌原点注射和尾静脉注射。

心肌注射：

心肌注射是通过注射器或类似装置将药物直接注入心脏组织，多采用原位多点注射方式，注射体积10-20μL/site，3-5点注射，通常注射的总病毒量在2*10^11VG。与血管注射相比，心肌直接注射方法特异性更强，可以实现对感兴趣区域的高效转导，但表达不均匀，只在注射部位周围的区域进行表达。

具体操作分为几个步骤：

1，在进行AAV注射前，小鼠需要麻醉以减轻疼痛和不适。常用的麻醉方法包括全麻和局麻，具体使用哪种方法视实验需求而定。剔除颈部至胸部毛发，方便接下来的解剖工作。

2，在小鼠麻醉后，刀片至胸腔，胸骨中线第三肋间处开一公分左右的小切口，剪断肋骨将心包撕开使得心脏暴露出来，将无菌棉片置以隔开心肺，便于后续的注射操作。

3，打开胸腔的同时，使用碘伏注射区域进行消毒，以减少感染的风险。

4，准备好AAV病毒，对心脏表面选择等距离3至5个位点进行注射，每个位点10-20μL病毒量，保证病毒扩散效果。以汉一生物提供的病毒为例：一般滴度1*10E13vg/ml以上，取20μL原液即包含2*10E11vg病毒总量，加30μL的pbs或生理盐水稀释到50μL体积分3-5个点注射（建议使用50ul的Hamilton 微量注射器）

5，注射完成后，对胸腔逐层缝合。由于原位注射对小鼠的损伤较大，注射后需暴露心脏监测2-5min，待心脏恢复正常窦性节律后，缝合切口。完成手术后需要对小鼠情况进行恢复观察。

6，注射4周后可进行采样观察病毒表达情况。

原位注射适用于对实验要求特异性高，只能在心脏处观察，其他部位不可以观察到病毒表达的情况。另心肌细胞分裂能力差，用此方式注射病毒不会扩散到其他部位。但是这种方法有一个弊端，需要采用开膛手术，对操作者要求比较高，而且动物伤害性比较大，有可能出现动物死亡。

注：本文操作以小鼠为例，若想了解大鼠等动物详细操作可联系汉一生物各地销售。

案例1

成年大鼠；心肌原点注射；总量4×1011 VG，共750μL（150μL×5点）；注射8周后检测。

案例2 心脏重构

本研究中，作者用血管紧张素II（AngII）诱导小鼠心脏重塑模型，探讨ZBTB20在心脏重构中的作用。研究发现ZBTB20在AngII诱导的心脏重塑和心肌细胞损伤反应中表达升高；AAV9（心肌注射）介导的ZBTB20过表达，可导致心壁肥厚、心室扩张、纤维化增加和射血分数降低，而敲低ZBTB20后可保护心肌细胞免受AngII诱导的肥大影响。从分子机制来看，ZBTB20通过EGFR-Akt信号通路加重AngII诱导的心脏重塑反应，本研究阐明了ZBTB20在不良心脏重构向心力衰竭的转变中的作用，并为诱导不良心脏重构的分子机制提供了依据。

尾静脉注射：

将小鼠固定后通过尾部侧面的静脉注射使药物传递到心脏。尾静脉注射易于操作，但是特异性较心肌注射稍弱，注射体积在100μL-200μL左右，由于载体在全身广泛分布，注射剂在血容量中会被稀释，所以通常需要较高的病毒滴度。建议使用我司提供的1*10E13vg/ml以上滴度病毒。详细操作可以参考汉一生物公众号：AAV尾静脉注射操作分享

案例3

6-8周龄小鼠；尾静脉注射；总量3×1011 VG（200μL）；注射3周后免疫组化。

案例4 高血压性心脏重塑

本研究中作者对OA在高血压性心脏重塑中的作用进行了探讨。通过检测伴有和不伴有LVH高血压患者的血浆代谢谱，研究人员发现伴LVH高血压患者的外周血中OA水平显著降低，并先后通过体外及体内研究证实OA可显著降低Ang II(血管紧张素II)诱导的心肌细胞生长、心肌成纤维细胞胶原表达和小鼠心脏重塑。RNA测序进一步发现FGF23(成纤维细胞生长因子23)在Ang II诱导反应中表达显著上调，而在OA处理后表达明显受抑。利用AAV9载体过表达FGF23（尾静脉注射）可加重Ang II诱导的心脏重塑，并削弱OA对心脏重塑的保护作用，进一步研究发现OA通过阻断Nurr1(核受体相关蛋白)从细胞质到细胞核的易位抑制Ang II诱导的FGF23表达，深入揭示了OA在防止Ang II诱导的心脏重塑中发挥关键作用。