QPCR与WB检测
QPCR（实时荧光定量PCR）和WB（Western Blot，蛋白质免疫印迹）是分子生物学中常用的检测技术，分别从核酸和蛋白质水平分析目标分子，核心区别与应用如下：
（一）.QPCR（实时荧光定量PCR）
1.原理
通过荧光信号实时监测PCR扩增过程，定量检测目标基因的mRNA表达量。利用Taq酶的5'→3'外切酶活性或荧光探针（如SYBR Green、TaqMan探针），随扩增产物增加，荧光强度与模板量呈正相关。
2.主要步骤
①RNA提取：从样本中提取总RNA（需去除基因组DNA污染）。
②逆转录：将RNA逆转录为cDNA。
③QPCR反应：以cDNA为模板，加入引物、荧光试剂进行PCR，实时监测荧光信号。
④数据分析：通过标准曲线或2^(-ΔΔCt)法计算目标基因的相对表达量。
3.应用
①基因表达量分析（如药物处理后基因转录水平变化）。
②病原体定量（如病毒载量检测）、基因分型等。
（二）WB（Western Blot，蛋白质免疫印迹）
1.原理
通过电泳分离蛋白质，转印至膜上，利用抗体特异性结合目标蛋白，通过显色（如化学发光、DAB）检测蛋白表达量或修饰状态。
2.主要步骤
①蛋白提取：裂解细胞或组织，提取总蛋白并定量。
②SDS-PAGE电泳：按分子量分离蛋白质。
③转膜：将蛋白转移到PVDF或NC膜上。
④封闭：用脱脂奶粉或BSA封闭非特异性结合位点。
⑤抗体孵育：一抗（特异性识别目标蛋白）和二抗（标记酶或荧光基团）依次孵育。
⑥显色与检测：化学发光或显色液显色，拍照并分析灰度值。
3.应用
①检测蛋白表达水平、蛋白修饰（如磷酸化、乙酰化）。
②验证蛋白互作（如Co-IP后的WB检测）、蛋白分子量鉴定等。
4.核心区别对比
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QPCR |
WB |
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检测对象 |
mRNA(核酸水平） |
蛋白质（翻译后水平） |
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定量方式 |
荧光信号实时定量 |
灰度值半定量（需内参校正） |
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样本要求 |
RNA完整性（避免降解） |
蛋白活性（避免变性失活） |
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技术意义 |
反映基因转录活性 |
反映蛋白表达及功能状态 |
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