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腺相关病毒

       重组腺相关病毒(AAV)是一种在体外或体内实验中均被广泛使用的病毒载体。AAV可以转导大量类型的哺乳动物细胞,并且在人体中表现为无致病性和低免疫原性,这些特点使其成为当前应用于基因治疗领域中其中一种最高效的基因递送载体。

病毒类型

      单链AAV(Single-stranded AAV,ssAAV)和自互补AAV(Self-complementary AAV,scAAV)

      多种血清型:1、 2、3、4、5、6、6.2、7、8、9、rh10、DJ、DJ/8、PHP.eB、PHP.S、AAV2-retro、AAV2-QuadYF和AAV2.7m8等.

不同血清型的AAV组织感染嗜亲性各不相同,表现出一定的器官靶向特异性。

下表列举了不同的AAV血清型及对应的组织亲和性:

表格 1启动子一览表(蓝体载体待构建)

研究方向

启动子

大小

组织

来源

靶向细胞

神经系统

hSyn

448bp

成熟神经元

CaMKIIα

1289bp

锥体神经元

GFAP

681bp

星形胶质细胞

GFAP

2180bp

星形胶质细胞

GfaABC1D

923bp

星形胶质细胞

iba1

1889bp

小胶质细胞

VGAT

1.3kb

GABA能神经元

CRH

1281bp

神经

神经元

ChAT

894bp

神经

胆碱能神经元

CX3CR1

1.2kb

神经

小胶质细胞/巨噬细胞

OLIG2

/

小鼠

少突胶质细胞/前体细胞

Aldh1L1

994bp

神经

星形胶质细胞

hTh

524bp

多巴胺能神经元

mTh

303bp

小鼠

多巴胺能神经元

NSE

1807bp

神经

大鼠

多种神经元

Nes

1566bp

神经

大鼠

神经肝细胞/神经前体细胞

Cnp

3046bp

神经

小鼠

髓鞘寡突胶细胞/施万细胞

Tubala

1121bp

神经

大鼠

发育中的神经元

MIR218

908bp

脊髓

运动神经元

Thy1

2888bp

神经元

MBP

1951bp

神经

小鼠

少突胶质细胞

Gad1

625bp

神经

小鼠

GABA能神经元

MeCP2

229bp

神经

神经元

VGLUT1

2143bp

神经

小鼠

谷氨酸能神经元

VGLUT2

1787bp

神经

小鼠

谷氨酸能神经元

c-fos

1673bp

小鼠

神经元

肌肉

EnSM22a

594bp

平滑肌

小鼠

血管平滑肌细胞

MHCK7

775bp

骨骼肌/心肌

小鼠

横纹肌细胞

Nkx2.5

//

/

小鼠

心肌细胞早期特异性启动子

hDesmin

593bp

骨骼肌/心肌

骨骼肌/心肌/卫星细胞

Myog

1139bp

肌肉

小鼠

成肌细胞

ACTA1

2162bp

肌肉

成肌细胞

SMMHC

1394bp

肌肉

小鼠

平滑肌细胞

CK8e

450bp

骨骼肌/心肌

小鼠

横纹肌细胞

SPc5-12

345bp

骨骼肌/心肌/平滑肌

小鼠

分化后的横纹肌细胞

心血管系统

cTnT

717bp

心脏

心肌细胞

CD68

343bp

血管

单核巨噬细胞

CD68

659bp

血管

小鼠

单核巨噬细胞

F4/80

1.2kb

血管

巨噬细胞

tie1

1142bp

血管

小鼠

血管内皮细胞

ICAM2

389bp

血管

血管内皮细胞

CD144

1599bp

血管

小鼠

血管内皮细胞

CD31

851bp

血管

小鼠

血管内皮细胞

αMHC

2.8kb

心脏

小鼠

心肌细胞

Hcn4

2780bp

胚胎心脏

小鼠

心肌细胞

Pdgfrb

2.0kb

血管

小鼠

血管平滑肌细胞/少突胶质细胞前体细胞

CD206

2.0kb

血管

小鼠

巨噬细胞

Periostin

1394bp

心脏/骨

/

成纤维细胞

肝脏

TBG

410bp

肝脏

细胞

ALB

2.0kb

肝脏

/

成熟细胞

ApoEHCR-hAAT

1270bp

肝脏

细胞

LP1

545bp

肝脏

肝细胞

HLP

252bp

肝脏

肝细胞

骨组织

Col1α1

1.1kb

骨/牙齿/肌腱

成骨/成纤维细胞

Col2α1

1033bp

软骨组织

小鼠

软骨细胞

Osterix

1361bp

骨/牙齿/肌腱

小鼠

成骨细胞

Runx2

2514bp

骨组织

小鼠

早期成骨细胞

CD11b

1795bp

骨髓

成熟髓样细胞

OC

2141bp

骨/软骨

成骨/骨/肥大软骨细胞

肺组织

SPC

0.7kp

小鼠

肺泡II型上皮细胞/细支气管上皮细胞

SPC

339bp

小鼠

肺泡II型上皮细胞/细支气管上皮细胞

肾脏

KSP

1343bp

肾脏

小鼠

肾小管上皮细胞

NPHS2

2589bp

肾脏

足细胞

胰腺

Ins2

705bp

胰腺

小鼠

胰腺胰岛β细胞

HIP

1867bp

胰腺

胰腺胰岛β细胞

Pdx1

2930bp

胰腺

小鼠

胰腺祖细胞/胰腺β细胞

脂肪

AdipoQ(ADP)

1646bp

脂肪

小鼠

脂肪细胞

视网膜

RPE65

707bp

视网膜

小鼠

视网膜色素上皮细胞

ProA1

2000bp

视网膜

小鼠

视锥细胞

ProA7

500bp

视网膜

小鼠

视锥细胞

hRHO

839bp

视网膜

视杆细胞

Grm6

403bp

视网膜

小鼠

光双极细胞

Grm6

700bp

视网膜

小鼠

光双极细胞

Grm6

2197bp

视网膜

小鼠

光双极细胞

mRho

471bp

视网膜

小鼠

小鼠视紫红质启动子

hBEST1

623bp

视网膜

视网膜色素上皮细胞

SNCG

1446bp

视网膜

视网膜神经节细胞

CRYBB1

464bp

视网膜

晶状体上皮细胞

乳腺

MMTV

1315bp

乳腺

小鼠

乳腺上皮细胞

Wap

2444bp

乳腺

小鼠

乳腺肺泡上皮细胞

表皮组织

K14

2268bp

表皮组织

角质细胞

K19

2026bp

表皮组织

小鼠

角质细胞

mTyr

560bp

表皮组织

小鼠

黑色素细胞和黑色素瘤细胞

肿瘤

TERT

455bp

肿瘤细胞

人类端粒酶逆转录酶

Survivin

269bp

肿瘤细胞

癌细胞

Survivin

987bp

肿瘤细胞

癌细胞

/

Nanog

1334bp

/

小鼠

胚胎干细胞

 

表格 2 血清型组织噬性

血清型

组织亲和性

rAAV2/1

神经系统(高滴度顺向跨突触),肌肉,骨骼肌,心肌,平滑肌

rAAV2/2

视网膜、神经系统,肌肉,肝脏,血管平滑肌

rAAV2/3

肌肉,肝脏,肺,眼

rAAV2/4

神经系统,肌肉,眼,脑

rAAV2/5

神经系统,肺,视网膜,肝脏,滑膜关节

rAAV2/6

神经系统,肺,肌肉,心脏

rAAV2/7

肌肉,肝脏

rAAV2/8

神经系统,肝脏,肌肉,脂肪组织,胰腺,视网膜,

rAAV2/9

神经系统,心肌,肺,视网膜,皮肤

rAAV-Rh10

肝脏,血液,心脏,体外感染细胞

rAAV-phpb

突破血脑屏障

rAAV-retro

神经系统(逆向非跨突触)

rAAV-DJ

视网膜,肺,肾脏,体外感染细胞

rAAV-BR1

脑血管内皮特异性

腺相关病毒包装服务详情

                                                      基因干扰腺相关病毒载体选择

载体名称

启动子

荧光抗性

pAAV-U6-ZsGreen1

U6

ZsGreen1

AAV-TBG-EGFP-mir30base-shRNA

/

EGFP

AAV9-CMV-EGFP-U6-shRNA

U6

EGFP

                            其它个性化服务请联系我们

                                                      基因过表达相关病毒载体选择

载体名称

启动子

荧光抗性

AAV-CMV-3FLAG

CMV

无荧光

AAV-CMV-3FLAG-P2A-EGFP

CMV

EGFP

AAV9-ctnt

CTNT

无荧光

pAAV-ctnt-GFP

CTNT

GFP

AAV-TBG-3flag-EGFP

TBG

EGFP

                                              其它个性化服务请联系我们

生产

       我们通常使用三质粒系统包装重组AAV病毒。该系统采用一个携带目的基因的转移质粒、一个Rep-Cap表达质粒以及一个表达腺病毒基因(E2、E2A和VA)的辅助质粒共转染HEK293T包装细胞。细胞短暂孵育后,根据血清型的不同,收集上清或者细胞裂解液,PEG浓缩获取病毒颗粒。对于超纯化AAV(体内应用级别),再通过碘克沙醇对病毒颗粒进一步纯化和浓缩。

图1 三质粒法包装AAV的典型流程

        对于每一批我们生产的AAV病毒,我们的质量控制包括qPCR滴度检测、微生物负荷检测(针对细菌、真菌)、支原体检测等。若转移载体同时编码一个荧光标记基因,我们还会将病毒进行细胞转导以测定相应的荧光表达情况。此外,对于超纯化AAV病毒,我们还可以检测内毒素水平和使用SDS-PAGE方法检测病毒纯度。

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