双荧光素酶报告基因

萤（荧）光素（Luciferase）是自然界中能够产生生物发光的酶的统称，其中最有代表性的是来自萤火虫体内(Firefly)和海肾(Renilla)体内的两类萤光素酶，分别命名为F-Luciferase和R-Luciferase。萤火虫荧光素酶是从甲虫（Photinus pyralis）中分离得到，分子量为61kDa；海肾荧光素酶（Renilla Luciferase）则是从海肾（Renilla reniformis）中分离，分子量为36kDa。萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）和海肾荧光素酶（Renilla luciferase）之所以被称为报告基因，是因为在基因表达调控研究时，利用两者表达产生的荧光比值可以监控、证实微观层面上的分子间的相互作用。在荧光素酶的催化下，荧光素底物可以高效的转变成氧萤光素，同时发出强烈的光。常用来研究启动子的强弱和转录因子对启动子的作用或miRNA对目的基因或lncRNA的调控作用。

一、启动子区域结合研究

   转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异顺序结合，这些特异性的序列被称为顺式因子。转录因子的DNA结合域和顺式因子相互结合，从而对基因的表达起抑制或增强作用。双荧光素酶报告基因实验是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。将靶基因的转录调控元件或5’启动子区克隆在Firefly luciferase基因的上游，与转录因子表达质粒共转染到工具细胞内，检测细胞萤火虫和海肾荧光素酶表达，海肾荧光素酶表达作为内参，用于消除细胞转染等因素带来的组间误差；若转录因子过表达后，荧光素酶活性升高，说明该转录因子能够激活相应的基因表达；反之，若荧光素酶活性降低，则转录因子可能抑制基因表达。

图1：启动子与转录因子相互作用检测工作原理

二、miRNA与3’UTR相互作用检测:

   利用荧光素酶报告系统体外验证miRNA潜在靶基因。3‘UTR是位于编码基因终止密码子下游延伸至多聚A尾巴（Poly-A）的前端，通过自身结构或者与其他分子相互作用调控基因表达，miRNA与靶基因的3' UTR区域特异结合后调节靶基因的表达。将包含该mRNA 3'非翻译区 (UTR) 的片段克隆到含有荧光素酶基因的报告载体中，并将其转染到细胞中。如果miRNA可以结合到该UTR上，会抑制荧光素酶mRNA的翻译，从而降低荧光素酶的活性。通过比较有无miRNA的情况下荧光素酶活性的差异，可以验证miRNA是否真正调控了该靶基因。

图2：miRNA与3’UTR相互作用检测工作原理

三、客户提供

1.启动子活性分析：基因名称及ID；

2.转录调控：转录因子名称及ID、靶基因名称及ID；

3.miRNA靶基因验证：miRNA名称、物种信息、靶基因名称及ID；