蛋白纯化

1.蛋白纯化定义及原理：

       蛋白纯化是生物研究常用的一种技术，是指从蛋白混合物中得到纯度较高的某种蛋白的过程。根据样本和杂质的特性选择适合的纯化方法，纯化技术的选择要简单化，并且要产生最佳的纯化效果。如果纯度的要求很高，再增加一个离子交换或疏水作用色谱的额外中间步骤。不过尽量尝试使用尽可能少的步骤，因为步骤增多会降低总蛋白产出量。亲和步骤常用重力柱，有时其他色谱步骤中会使用恒压泵，然而蛋白纯化系统将提供更多的控制，可获得更详细的目标蛋白和杂质信息，并为色谱柱提供更好的保护。

2.核心目的

       获得高纯度的目标蛋白，用于研究其结构、功能、活性，或制备抗体、药物等。 

3.主要步骤及方法

       ①样品制备

       破碎细胞（如超声、高压均质）释放蛋白，离心或过滤去除杂质。

       ②粗分离

       盐析：通过添加硫酸铵等盐类，使蛋白因溶解度差异沉淀，初步分离。

       超滤：利用不同分子量蛋白在半透膜上的透过性差异，浓缩目标蛋白。

       ③精细纯化（常用色谱法）

       亲和色谱：利用蛋白与配体（如抗体、辅酶）的特异性结合，高效分离目标蛋白（如His标签蛋白用镍柱纯化）。

       离子交换色谱：根据蛋白表面电荷差异，通过离子交换树脂吸附和洗脱。

       凝胶过滤色谱：按蛋白分子量大小分离，大分子先流出，小分子后流出。

4.纯度鉴定

       ①SDS-PAGE电泳：通过蛋白条带判断纯度，单一清晰条带表明高纯度。

       ②质谱：确认蛋白分子量及序列，验证身份。 

5.关键影响因素

       ①pH和温度：避免蛋白变性，通常在4℃低温、适宜pH条件下操作。

       ②保护剂：添加蛋白酶抑制剂防止蛋白降解，用甘油等维持蛋白活性。

我们的优势

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